Bestämning av innehållet av bakterier och virus i avloppsvatten kan vara viktig på många ställen men utförs sällan beroende på olika brister och svagheter i använd analysmetodik. Användning av flödescytometri är en odlingsoberoende metodik för bestämning av celler i en vätska med hjälp av laserljus och där olika infärgningar kan medge en selektiv märkning av olika typer av mikroorganismer.
Av: Bengt Andersson
Vid uppföljning av driften av kommunala avloppsreningsverk fokuseras särskilt på fysikalisk-kemiska parametrar medan mikrobiologiska parametrar oftast försummas i rutinanalyserna. Eftersom ett kommunalt avloppsvattens innehåll av mikroorganismer, som till en del kan vara patogena och utgöra ett latent hot mot hälsa och miljö, uppvisar en stor variation kan det finnas behov av en ökad förståelse för förekommande variationer och reduktion av mikroorganismer i reningsprocessen.
Det vanliga måttet för mikrobiologisk karakterisering av utgående avloppsvatten är bestämning av E-coli, som används som en indikatororganism för bakteriell påverkan. Bestämningen sker genom odling på näringsplattor, vilket är arbetsintensivt och eftersom resultatet inte kan ges direkt passar det inte för tidskritiska applikationer som avloppsvattenkontroll. Bestämning av innehållet av virus i avloppsvattnet utförs sällan eftersom det saknas regler för detta.
Flödescytometri (FCM) är en odlingsoberoende metod för att analysera både bakterier och virus. Tekniken har inte använts i någon större utsträckning tidigare beroende på en mycket hög kostnad för instrumentet, behov av erfarna specialister för att utföra mätningen och avsaknaden av provkit med reagens för specifika applikationer. Robusta instrument till rimlig kostnad finns numera att tillgå som är lätta att använda, som är mera tillförlitliga och där provkit finns framtagna för olika typer av mikrobiologiska applikationer.
Mätningen genom FCM går ut på att celler passerar en och en genom en liten kanal där de belyses av en laserstråle, varvid reflekterat och avböjt laserljus mäts. Flödescytometri har tillsammans med fluorescensfärgning använts för bestämning av den totala cellkoncentrationen i prov från vattenverk med bra resultat. Vid analys av avloppsvatten med FCM måste proven disintegreras före färgning och analys.
Syftet med refererad undersökning var att utvärdera användningen av FCM som en snabb och direkt metod för kvantifiering av intakta och skadade bakterier och av virus i avloppsvatten efter olika reningssteg.
Genomförande av undersökningen
Prov från inkommande, försedimenterat och biologiskt renat avloppsvatten samt från aktivt slam och utgående avloppsvatten togs från ett kommunalt avloppsreningsverk i norra Kina uppbyggt med förbehandling och biologisk behandling i en aktivtslamanläggning samt med desinfektion av det renade avloppsvattnet med klor.
Efter utspädning och buffring behandlades proven med ultraljud för disintegrering. Inledningsvis undersöktes erforderlig specifik energi för ultraljudsbehandlingen för att uppnå en tillräcklig disintegration utan att förstöra intakta levande bakterier i alltför hög grad.
Fluorescensfärgning skedde med SYBR Green I (SGI), en asymmetrisk cyanidfärg som binds till DNA, och propodiumjodid (PI), som är ett interkalerande medel som tränger sig mellan DNA-strängarna och som är det mest använda färgämnet vid flödescytometri för att bestämma om cellerna är levande eller inte och för uppskattning av DNA-innehållet. Använd cytometer hade en laser som emitterade ljus vid 488 nm.
För jämförelse av resultatet av bestämningen av bakterier respektive virus utfördes analys av ATP och epifluorescensmikroskopi (EFM) enligt väldokumenterade metoder och protokoll.
Resultat
Inledande försök gjordes för att bestämma lämplig effekt för ultraljudsbehandlingen. Genom att öka den specifika energin vid behandlingen observerades en gradvis ökning av koncentrationen av bakterier och virus. Ett högsta värde uppnåddes vid en bestämd energi och över denna skedde ingen ökning av koncentrationen. Erforderlig specifik energi var olika för bakterier och för virus och för typen av avloppsvatten. Energin bör inte överskrida nivån då andelen levande bakterier förloras. Genom samtidig bestämning av andelen döda bakterier framgick att optimal nivå för specifika energin var omkring 160 kJ/l för bakterier och 40 kJ/l för virus för avloppsvattenprov och omkring 200 respektive 100 kJ/l för aktivt slam.
Resultaten visade entydigt att FCM var en snabb teknik med hög noggrannhet, där resultat förelåg redan efter 45 minuter efter det att förbehandling av proven påbörjats. Användning av PI- och SGI-färgningar gav en klar åtskillnad av intakta och skadade bakterieceller. En bra separering av virus från bakgrunden erhölls som medgav att virus kunde urskiljas från annat organiskt material och skräp. För att undvika överestimering av virus var det viktigt att proven filtrerades genom ett membranfilter med 0,22 mm poröppning för att filtrera bort produkter från nedbrytning av bakteriernas cellväggar.
Det totala antalet bakterier per ml avloppsvatten uppgick till 1,7*108 i inkommande avloppsvatten, vilket är mellan 10 och 100 gånger högre än i naturligt ytvatten. Avskiljningen genom försedimentering uppgick endast till knappt 30 % eftersom flertalet bakterier finns fritt suspenderade. Bakterieantalet i det aktiva slammet uppgick till drygt 2*109 och det minskade till omkring 3,9*108 efter slutsedimentering. Kloreringen innebar att bakterieantalet minskade med två tiopotenser till omkring 4*106, vilket motsvarade antalet i naturliga vatten.
Den procentuella fördelningen av döda bakterier var högst i inkommande avloppsvatten, där andelen uppgick till 42%. Andelen var något lägre i försedimenterat avloppsvatten (cirka 26%) och ytterligare lägre i det aktiva slammet och i det eftersedimenterade avloppsvattnet (cirka 13 á 14%). Andelen döda bakterier ökade i utgående avloppsvatten beroende på effekten av kloreringen.
Innehållet av virus per ml avloppsvatten var drygt 4*108 i det försedimenterade vattnet, vilket var något högre än i inkommande avloppsvatten. Mängden virus ökade kraftigt i det aktiva slammet där antalet bestämdes till drygt 7,3*109 per ml och där ökningen troligtvis berodde på riklig förekomst av bakteriofager. Antalet virus minskade efter slutsedimentering till ungefär samma nivå som i inkommande avloppsvatten (3,7*108 per ml) medan kloreringen inte hade någon effekt på antalet virus.
Resultatet av FCM jämfördes med vanligen tillämpade metoder för bestämning av bakterier och virus. ATP har betraktats som en bra indikator för kvantifiering av intakt biomassa, där koncentrationen relateras väl till koncentrationen av intakta mikrobiella celler. Resultatet av studien visade en bra överensstämmelse mellan den cellbundna ATP-koncentrationen och bestämning av bakterier med FCM. Mikroskopering med EFM är en vanlig metod för bestämning av virus och en jämförelse visade även en bra överensstämmelse med bestämning med FCM även om FCM genomgående gav ett något större antal virus än EFM.
Slutsatser
Följande slutsatser kunde dras av undersökningen:
- Kombinationen av ultraljudsbehandling och flödescytometri (FCM) är en effektiv och snabb metod för att bestämma innehållet av bakterier och virus i avloppsvatten.
- FCM ger bättre möjligheter än odlingsberoende metoder för övervakning av innehållet av bakterier och virus i utgående avloppsvatten och av variationerna efter olika reningsprocesser.
- Ytterligare undersökningar av avskiljning av bakterier och virus i avloppsvatten från flera avloppsreningsverk och med andra reningsprocesser kan ge ökade kunskaper till bättre utformning och optimering av specifika reningsprocesser för avskiljning av bakterier och virus.
Källa: L. Ma, G. Mao, j. Liu, G. Gao, Y. Wang. Rapid quantification of bacteria and viruses in influent, settled water, activated sludge and effluent from a wastewater treatment plant using flow cytometry. Water Science & Technology 68.8 (2013) pp 1763 – 1769.
Hela artikeln i Water Science & Technology finns här.
