E. Coli-celler som exciteras kan emittera ljus. Mera speciellt kan vissa excitationsvåglängder indikera förekomst av aminosyran tryptofan, som är viktig i många proteriner. Vid excitationsvåglängden 280 nm och emissionsvåglängden 360 nm korrelerar fluorescensen väl med förekomst av tryptofan i provet. Denna mätning kallas därför tryptofanliknande fluorescens (TLF). TLF korrelerar särskilt väl med intracellulärt tryptofan, vilket gör att det är möjligt att få en uppfattning om hur många E.Coli-celler som finns i ett undersökt prov.
Av: Kenneth M Persson
Fluorescens är en fysikalisk process där ett material eller en förening sänder ut ljus (luminiscerar) efter att den tagit upp energi (exciterats) vilken direkt därefter sänds ut (emitteras), normalt vid en längre våglängd. Fluorescens är kortlivad och ljus emitteras inom millisekunder efter att föreningen exciterats. Det innebär att fluorescensmätningar kan göras mycket snabbt och ge snabb information om hur till exempel ett vattenprovs innehåll av fluorescerande ämnen ser ut och kanske varierar i tid. Fluorescens påverkas av många olika faktorer som pH, temperatur, metallhalter (järn, mangan, koppar och aluminium) och innehåll av organiskt material. Bara en bråkdel av allt organiskt material som absorberar ljus kan fluorescera, men eftersom det går att mäta fluorescens.med hög precision, är fluorescens ofta tillräckligt för att kunna karakterisera organiskt material i vatten.
Fluorescens kan mätas vid specifika våglängder eller i hela våglängdsområde. De senare kan presenteras som exicitations-emissionsspektra (EEM) som ger en bred information om till exempel hela luminiscensen hos ett vattenprov. Olika kemisk ämnen ger upphov till olika EEM, vilket betyder at det går att hitta specifika fingeravtryck för flera olika ämnesgrupper, som aromatiska föreningar, proteiner eller hemicellulosa. Det innebär också att det kan gå att korrelera EEM-spektra med specifika halter av olika organiska föreningar och hur de varierar i tiden, särskilt om vattnets kemiska sammansättning för övrigt är förhållandevis stabil. En detaljerad genomgång av vad som kan göras med EEM finns redovisad i SVU-rapporten 2015-13 (Köhler och Lavonen).
Sorensen och medarbetare (2018) har använt fluorescens i grundvatten och i något fall ytvatten från vattentäkter i Zambia, Malawi, Sydafrika och Indien för att se om metoden kan användas för att snabbt, inom loppet av några sekunder, mäta halten termotoleranta E.coli-bakterier i vattenprover. Detta är en viktig indikatororganism som berättar om risken för smitta från avlopp och avföring i dricksvattnet. En standardanalys av E.coli sker genom odling i näringslösning och tar minst 18 timmar, ofta mer. Snabbmetoder för att mäta E.coli är alltid mycket relevanta för kontroll och övervakning av dricksvattenkvalitet. I majnumret av Science of the total environment redovisar de resultaten av sina mätningar.
Det är dokumenterat sedan 1980-talet att E. Coli-celler som exciteras kan emittera ljus. Mera speciellt kan vissa excitationsvåglängder indikera förekomst av aminosyran tryptofan, som är viktig i många proteriner. Vid excitationsvåglängden 280 nm och emissionsvåglängden 360 nm korrelerar fluorescensen väl med förekomst av tryptofan i provet. Denna mätning kallas därför tryptofanliknande fluorescens (TLF). TLF korrelerar särskilt väl med intracellulärt tryptofan, vilket gör att det är möjligt att få en uppfattning om hur många E.Coli-celler som finns i ett undersökt prov.
Men hur exakt är en sådan mätning? En del TLF kommer inte från tryptofan. En del tryptofan är extracellulär och finns alltså löst i vatten utan att vara kopplad till bakterieceller. I artikeln redovisar Sorensen och medarbetare hur de samlat in och sammanställt data från total 564 vattenprover, huvudsakligen grundvattenprover, från Indien och de tre afrikanska länderna. Alla provernas halt av E.coli eller termotoleranta koliforma bakterier hade också bestämts genom odling; antingen med vanlig odling på agar eller med den snabbare colilertmetoden. Ungefär hälften av proven visade förekomst av E.coli (289 st) medan knappt hälfen saknade E.coli (275 st). Vattenproven undersöktes därefter med fluorescens enligt TLF-index vid 280 nm respektive 360 nm. Forskarna tog fram en regressionsmodell från TLF som en prediktor för förekomst av termotoleranta koliformer (TTC) i proven. De valde att sätta tröskelvärdet på 1,3 ppb (nanogram per liter) upplöst tryptofan i vattenprovet mätt med fluorescens som tecken på E.coli-kontaminering. Vid validering av detta tröskelvärde fick de falska negativa värden i 15% av fallen, det vill säga TLF-index angav avsaknad av E.coli medan vattenprovet de facto innehöll E.coli. I 18% av fallen fick de istället en falsk positiv signal från TLF-index, som alltså visade på kontaminering utan att bakterier kunde odlas framt.
TLF-index fungerade inte för att klassificeringen vatten som innehöll <10 cfu termotoleranta E.coli per 100 ml. Men om endast vattenprov över denna gräns klassificerades var den falska negativa felkvoten låga 4%. TLF-intensiteten var tydligt korrelerad med mängden E.coli i vattenprov (p = 0.80). Om tröskelvärdet lades högre, på 6,9 ng/l tryptofan i vattnet, kunde starkt förorenade källor (≥ 100 TTC cfu per 100 ml) identifieras med hög precision.
Det finns redan flera kommersiellt tillgängliga fluorimetrar på marknaden som är lätta att bära med sig, enkla att använda och därmed lämpliga för användning online och ute i fält. Fluorimetrar behöver inte reagenser eller förbrukningsmaterial och kan programmeras för att leverera ett ögonblickligt resultat. TLF-mätningar påverkas inte märkbart av interfererande ämmen (pH, turbiditet och temperatur) inom typiska naturliga områden. Tekniken är därför ett klart intressant alternativ för realtidsundersökning av fekalt kontaminerat dricksvatten globalt. Kostnaden för en mätare är 50tkr-75tkr.
Att göra TLF-mätningar i fält bör övervägas som ett snabbt sätt att få en uppfattning om graden av förorening i ett vattenprov. Också snabba recipientkontrollmätningar och badvattenkvalitetsmätningar kan bli hjälpta av denna metod, dock efter validering för respektive plats. Om TLF används regelbundet tillsammans med E.coli-odlingar går det att bygga upp en erfarenhetsbaserad databas för den egna situationen. Men metoden räcker inte till för att indikera en måttlig kontamination ännu. Det är inte heller självklart att tryptofan bara korrelerar med E.coli. Tryptofan förekommer i många protein i många olika bakterier.
Skall TLF-metoden växa till sig, behövs fler studier och mer praktik.
Källa: James P.R. Sorensen, Andy Baker, Susan A. Cumberland, Dan J. Lapworth, Alan M. MacDonald, Steve Pedley, Richard G. Taylor, Jade S.T. Ward: Real-time detection of faecally contaminated drinking water with tryptophan-like fluorescence: defining threshold values. Science of The Total Environment (2018) 622–623, 1250-1257
