I en jämförelse mellan fyra olika metoder för att bestämma bakteriehalten i dricksvatten har en grupp franska forskare undersökt den bakteriella vattenkvaliteten i ett vattenverk efter chockklorering, slutklorering och avklorering med natriumbisulfit. De metoder man använde var flödescytometri, (FCM), fastfascytometri, (SPC), epifluorescensmikroskopi, (MSP) och traditionella odlingsmetoder.
Av: Kenneth M Persson
Det är tydligt att flödescytometri för mikrobiell kvalitetskontroll i dricksvattenverk kommer starkt som metod. Bakterier förekommer överallt, inklusive i dricksvatten. Dricksvattenföreskrifterna säger att det distribuerade dricksvattnet skall vara hälsosamt och rent, och vara fritt från patogener. Därför måste alla som arbetar med dricksvatten sträva efter att leverera ett hygieniskt vatten. Desinfektion är standard för beredning i vattenverket, men den ständiga frågan som vattenverksoperatörerna brottas med är om desinfektionen är tillräcklig, om dricksvattnet är fritt från patogena organismer, ja om dricksvattnet är säkert. De metoder som används för att bekräfta att så är fallet är fortfarande baserade på olika odlingar i näringslösningar, vilka tar lång tid och är ganska trubbiga då bara vissa organismer behagar växa i den näringslösning de matas med.
I miljön kan bakterier skadas eller inaktiveras på flera olika sätt, inklusive brist på näringsämnen, cellåldrande, genom att de blir föda åt större organismer, som protozoer eller att de skadas av virusangrepp. De desinfektionssteg som används i vattenverk påverkar olika delar av bakterien. Klor angriper huvudsakligen bakteriens ytterskal, dess cellvägg, medan UV-ljus orsakar oxidationsskador i framför allt DNA-molekylen, som inte kan delas efter UV-behandling. Andra metoder kan inaktivera viktiga enzymer i bakterien och hämma dess metabolism. Tillsatts av kvicksilver är ett sådant exempel (men föga använt som desinfektionsmedel längre, lyckligtvis).
Med hjälp av moderna analysmetoder kan antalet bakterieceller i vattenprov fastställas på olika sätt och skillnader mellan metabolisk aktivitet för bakteriecellerna tas fram genom tillsats av olika reagens som binder in till cellen eller omsättas av cellen. Exempel på sådana reagens är DAPI (4’,6’-diamino-2-fenylindol), som binder till bakterie-DNA. En annan liknande förening är SYBR Green II som också binder till DNA. DAPI fluorescerar i blått och SYBR Green II i grönt. Propidiumjodid (PI) kan bara tränga igenom en skadad bakteriecellvägg. Bakteriens ämnesomsättning kan mätas med CFDA, som bildar ett fluorescerande ämne om det metaboliseras av enzymet esteras i bakterien. CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazoliumklorid) är en fluorescerande markör som används för att mäta att den vanliga cellandningen fungerar genom dehydrogenasaktivitet. Chemchrome V6 är ett reagens som visar esterasaktivitet i levande celler genom grön fluorescens. Så genom att kombinera olika optiska system tillsammans med fluorescerande färgämnen för att följa specifika fysiologiska tillstånd hos bakterien går det att tämligen snabbt mäta levande celler, totalantalet celler och skadade celler.
Studien
I en jämförelse mellan fyra olika metoder för att bestämma bakteriehalten i dricksvatten undersökte en grupp franska forskare den bakteriella vattenkvaliteten i ett vattenverk efter chockklorering, slutklorering och avklorering med natriumbisulfit. De metoder man använde var flödescytometri, (FCM), fastfascytometri, (SPC), epifluorescensmikroskopi, (MSP) och traditionella odlingsmetoder. Skälet till att en så resolut klorering användes var att forskarna önskade se om de olika metoderna kunde skilja på totalantal bakterier, både levande och döda, levande och odlingsbara bakterier samt levande men inte odlingsbara bakterier.
Det totala antalet bakterier mättes med hjälp av SYBR Green II (för FCM) och DAPI (för MSP). För att skilja på levande och icke-levande bakterier (för FCM) färgades de med SYBR Green II och propidiumjodid. Aktiva celler mättes med hjälp av CTC (för MSP) och Chemchrome V6 (för FCM och SPC). I sina mätningar såg forskarna att mikroskoperingsmetoden korrelerade väl med flödescytometrin för både totalantal celler och aktiva celler. Men å andra sidan liknade fastfascytometriresultaten inte FCM-mätningarna då totalantalet mättes. Med hjälp av de traditionella odlingsmetoderna kunde forskarna visa att en del bakterier återhämtade sig och började dela sig också efter klorering. Avdödningen var inte absolut.
Vattenprover togs ut från ett vattenverk där vattnet klorerades genom kraftig klorering (klorhalter omkring 1,5 mg/l, CT-värden omkring 150-250 mg/l *min) för att sedan avkloreras genom tillsats av natriumbisulfit. Prover togs före och efter klorering, samt efter lagring omkring 24 timmar för att simulera uppehållstid.
Med hjälp av flödescytometri och infärgningsreagens gick det att få en god bild av den bakteriella kvaliteten med avseende på totalantal bakterier och antalet levande celler i proven inom 1 timme efter att proven började att analyseras. Fastfascytometrin (SPC) innefattar flera preparationssteg med fastläggning av prov på filteryta och fixering, vilket gör den något mera tidsödande. Efter ungefär 2½ timme fanns resultat från SPC, som dock gav 1-log systematiskt lägre resultat än FCM. Mikroskopering är ytterligare något långsammare och kunde leverera tillförlitliga resultat inom 3 timmar, medan odlingsmetoderna kunde ge tillförlitliga resultat först efter två dygn. Sammantaget visade metoderna på att bakterier återhämtade sig också efter mycket hårdhänt desinfektion.
Totalantalet celler var i storleksordningen 105 st per milliliter, varav minst 80% av levande men inte odlingsbara enligt flödescytometrimätningarna. Även efter chockklorering gick det att hitta levande celler i 72% av proverna med hjälp av MSP-mikroskopi, men i lägre koncentration. En del reagens kan ge falska positiva svar, så om bakterierna verkligen kunde leva var inte helt säkerställt. Å andra sidan visade de traditionella odlingsmetoderna med närningslösning av det fanns kolonibildande enheter i 39% av de klorerade vattenproven. Bakterier är mycket tåliga organismer.
Slutsatser
Forskarna var mycket nöjda med de snabba svar som FCM kunde ge såväl för totalantalet bakterier som antalet levande. Men de konstaterar korrekt att det finns andra organismer i vatten än bakterier. För att flödescytometri skall vara riktigt intressant bör infärgningsmetoderna kompletteras för parasitiska protozoer, virus eller endosporer genom olika kombinationer av nukleinsyraprober, fluorescerande antikroppar eller färgämnen som förändras i enzymatiska reaktioner. För att flödescytometri skall kunna slå igenom brett som kontrollmetod i driftlaboratoriet krävs analysprecision också för virus och protozoer. Men klart är att den redan i dagsläget kan användas fullt ut för kontroll av bakteriekvalitet i dricksvatten.
Källa: K. Helmi, F. Barthod, G. Méheut, A. Henry, F. Poty, F. Laurent and N. Charni-Ben-Tabassi. Methods for microbiological quality assessment in drinking water: a comparative study. Journal of Water and Health 13.(1) 2015 ss 34-41
