Forskarna gör jämförelser av variationer i dricksvattenekologi under ett dygn avseende provtagningsplatser, provtagningsrutiner, sätt att använda PCR-förstärkning (polymerskedjereaktionen och amplikonsekvensering.
Av: Kenneth M Persson
Teknikutveckling inom mikrobiell analys gör att en mängd spännande mätningar kan göras som förr inte var möjliga. Bland anant går det numera att följa litet noggrannare vad som händer med dricksvattnets sammansättning när det passerar de gigantiska reaktorer som vi kallar dricksvattenledningar, där en rad kemiska, fysikaliska och biologiska mekanismer påverkar vattenkvaliteten. Varje svensk har i genomsnitt åtta meter egna dricksvattenledningar i gatan och minst lika mycket i bostaden. Men när det gäller kunskap och insikt är det som vanligt för tidigt att säga något tvärsäkert om vad resultaten från sådana noggrannare mätningar egentligen betyder. Just nu är det som en spännande följetong där vi inte har en aning om slutet mer än att det måste vara lyckligt.
Artikeln
Under de senaste tio åren har systematiska studier visat att den mikrobiella ekologin bland annat varierar som funktion av råvatten, vilka beredningsmetoder som används i vattenverket, hur grovt eller finmaskigt ledningsnätet är, vilka material ledningsnätet består av eller hur flödet varierar under dygnet. Bautista-de los Santos och kolleger har undersökt hur den mikrobioella ekologin i dricksvattnet från fem olika vattenledningar varierar under dygnet (Bautista-de los Santos, 2016). Studien är noggrann och omfattar jämförelser av variationer i dricksvattenekologi under ett dygn avseende provtagningsplatser , provtagningsrutiner, sätt att använda PCR-förstärkning (polymerskedjereaktionen, dvs. mångfaldigande av DNA från analyserade bakterier) och amplikonsekvensering.
Dricksvattenprover samlades in i augusti 2013 från kranar i fem bostäder i där fyra var belägna i samma dricksvattennät i Skottland och en femte låg i ett annat nät. Vattenverket för de fyra första proverna har ytvatten som råvattentäkt och bereder vattnet genom flockning, snabbsandfiltrering, klorering och ortofosfatdosering för korrosionsskydd. Det femte provet togs i ett nät som matas från två olika ytvattenverk med olika beredningssteg, men med konventionell teknik.
Vattenproverna togs ut som samlingsprover under sex fyratimmarsperioder under ett dygn vilket gav sex prover (för klockan 08-12, kl. 12-16, kl. 16-20, kl. 20-00, kl. 00-04 och kl. 04-08). Provtagningen gjordes med konstant rinnande vatten från klordesinficerad provtagningskran genom att kranen efter renspolning 15 min justerades till en flödeshastighet av cirka 200 till 400 ml/min, som hölls konstant under hela provdygnet. Dricksvatten pumpades från en steril bägare placerad under kranen, med hjälp av en peristaltisk pump (hastighet = 75 varv per minut) försedd med steril slang och kopplingar till tre sterila Sterivex-filter med 0,22-µm porstorlek polyetersulfonmembran (Millipore, Billerica, MA ). Totalt 13-17 l dricksvatten filtrerades genom var och en av trippelfilter vid varje provtagningsperiod. Membranen med avskiljda bakterier togs ut från filterhuset och flyttades aseptiskt till ett kylförvar och därefter inom 24 timmar till ett frysförvar för att minimera återväxt.
PCR-förstärkning gick att genomföra för 246 av 270 valda PCR-bibliotek, där 239 prov hade tillräcklig PCR-produkt för att vara fungera för DNA-sekvensering. Efter provförberedelser och kvalitetskontroller fanns 14.726.834 sekvenser att läsa med ett genomsnitt på 61.619 ± 101.067 läsningar per provbibliotek som klustrades i 6080 operativa taxonomiska enheter (OTU), vilket ungefär motsvarar bakteriearter definierade på DNA-nivå. För alla fem provplatserna dominerar Proteobacterier (> 98% i samtliga fall). För tre av platserna var Betaproteobacterier (92,2 ± 3,3%) dominerande över Alfaproteobacterier (7,3 ± 3,6%), medan det var tvärtom för de andra två, där Alfaproteobacterier (76,6 ± 10%) var vanligare än Betaproteobacterier ( 22,9 ± 10%). Sju OTU av klasserna Afaproteobacterier, Betaproteobacterier och aktinobakterier förekom i alla prov och var bland de tio mest förekommande OTU i varje provtagningsplats. Av dessa sju OTU kunde sex identifieras på familj/släktnivå som Comamonadaceae (64,9 ± 38%), Sphingomonadaceae ( 2,22 ± 1,35%), Hyphomicrobiaceae ( 1,36 ± 0,8%), Methylophilus ( 0,62 ± 0,79%), Sphingomonas (0,24 ± 0,05%) och Mycobacterium ( 0,1 ± 0,07%), medan den sjunde bara kunde klassificeras som Alfaproteobacterier (31 ± 38,2% ). Därutöver kunde en mängd mera sällsynt förekommande OTU identifieras på familj- eller släktnivå, bland dem acidobacteria, Bacteroidetes, chlamydia, Chloroflexi, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Planctomycetes och Verrucomicrobia.
Multivariata analyser av OTU-resultaten från studien visade att skillnaderna mellan triplettproverna som togs i varje fyratimmarsprov var små och statistiskt osignifikanta. Däremot varierade sammansättningen för tre av de fem provtagningsplatserna signifikant över dygnet för tidsperioderna kl. 12-16, kl. 16-20 och kl. 04-08, men inte för tidsperioderna kl. 08-12, kl. 20-00 och kl. 00-04.
Den fysikalisk-kemiska vattenkvaliteten varierade inte över dygnet, men däremot de hydrauliska förhållandena i ledningen. Nattmätningarna var jämna och stabila. Morgon och kväll varierade sammansättningen mera. Men proverna visade också på att ett fåtal OTU dominerade den mikrobiella sammansättningen fullständigt. Cirka 10 OTU svarade för >99% av mätningarna. De hydrauliska förhållandena påverkar uppehållstid och skjuvning av biofilm – vid höga flöden kan mera av den ytligt belägna biofilmen spolas ut i vattnet. Då rivs den loss och följer med vattenflödet nedströms.
Slutsatser
Metodologiskt menar Bautista-de los Santos och medarbetare att för rika och mycket komplexa miljöer, som jord, där den mikrobiella mångfalden är hög och mängden biomassa stor, är det viktigt att försöka förfina sekvenseringen för att få så hög upplösning som möjligt, medan PCR-replikering (mångfaldigande av samma DNA) är mindre väsentlig. En dricksvattenledning är däremot ganska homogen och stabil och liknar inte ett jordprov. Då blir det istället viktigt att hitta avvikande bakterier som inte förekommer så ofta i bulkprovet. Exempelvis om man vill mäta på vad hydrauliska variationer kan åstadkomma för mikrobiella förändringar i dricksvattnet, blir det viktigt att replikera noga så att även de mindre vanliga DNA-strängarna mångfaldigas och lyfts fram till sekvenseringen. Det kan vara viktigt att inte missa de lossrivna samlingarna av biofilm som mer eller mindre slumpmässigt dyker upp i vattnet när det går undan i vattenflödet.
Artikeln är intressant och visar på hur viktigt det är att veta vad man mäter. En samordnad mätning av den faktiska biofilmen som växer på insidan av dricksvattenledningen med mätningar av hur mycket som rivs loss till bulkvattnet verkar vara en nödvändig väg framåt för biofilmsfantasterna. Missa inte nästa avsnitt.
Källa: The impact of sampling, PCR, and sequencing replication on discerning changes in drinking water bacterial community over diurnal time-scales2016, 90, 216–224.
Hela artikeln finns att köpa här.
