Flödescytometri utmanar konventionell analys av antal heterotrofa bakterier för den dagliga kontrollen av dricksvattnets mikrobiologiska kvalitet.
Av: Thor Wahlberg
Sedan mer hundra år använder dricksvattenproducenter HPC – heterotrophic plate counts för analys av antal heterotrofa bakterier. Detta görs för att upptäcka försämrad vattenkvalitet. Det är en rutinanalys som har utvecklats men är i grunden lika den som togs fram av Robert Koch år 1871. Flödescytometri (FCM – flow cytometri measurement) är en analys som bygger på att bakterier räknas. Efter många års tillämpning i dricksvattenforskningen används den nu som analysmetod vid vattenverk. Den används inte istället för HPC utan för att den ger helt andra möjligheter att kontrollera den mikrobiologiska kvalitén. I denna artikel ställs frågan om det är möjligt att slopa HPC analyser och låta FMC ersätta dessa. Artikelförfattarna menar att det FMC är ett bättre alternativ än HPC. I artikeln ges argument och bakgrund till påståendet. Det görs genom en genomgång av de senaste 15 årens utveckling av FCM.
Artikeln
Det är ett oomtvistligt krav att övervaka den mikrobiologiska kvaliteten genom vattenverkens olika beredningssteg och på ledningsnätet, för att upptäcka kontaminering eller försämring under distribution av dricksvatten. Innan Koch tog fram odlingstekniken som är grunden i dagens HPC fanns bara lukt, smak och kemiska basanalyser att tillgå. T.ex. så visade John Snow år 1850, utan tillgång till mikrobiologiska analyser, sambandet mellan kolerautbrott och dricksvatten.
HPC innebär odling av bakterier på s.k. agarplattor. En fördel med HPC är att de bakterierna som räknas är otvetydigt livskraftiga. Nackdelen att så få av de livskraftiga bakterietyperna låter sig odlas fram. Flera olika odlingsbetingelser och gränsvärden finns för HPC beroende på land och lagstiftning. Ursprungligen sattes en gräns på 100 cfu/ml (Koch 1870-tal) som en risknivå för utbrott av kolera. Det har sedan dess utvecklats andra näringssubstrat och andra temperaturer under vilka inkubation sker. Men det är väl känt att vilka bakterier som odlas fram beror på vilka förhållanden inkubationen görs under. Den osedda majoriteten av bakterier består av två grupper. Först de som är levande men inte odlingsbara pga. skada i cellmembranet och de som inte har rätt miljöbetingelser för att växa till. Bägge grupperna kan växa till genom att de reparerar sitt cellmembran eller miljöbetingelserna ändras. Den andra gruppen är de som inte kan växa till med den näringslösning och de övriga förutsättningar som HPC medger. Poängen är att HPC inte kan visa på deras förekomst och frekvens.
Artikeln visar på att det finns flera alternativ till HPC. Förutom FMC beskrivs ATP, mikroskopering, qPCR och DNA kvantifiering. En jämförelse redovisas av respektive metods möjlighet att kvantifiera biomassan för alla aktiva bakterier.
Vad är då FCM? Det är en analysmetod som används för cellanalys (bakterier är encelliga mikroorganismer). I dricksvatten kan metoden, med hjälp av infärgning och fluorescensmätning, mäta totala antalet bakterieceller. Genom att skicka laserljus tvärs och i olika vinklar genom ett tunt rör, i vilket vätska passerar, kvantifieras bakterier och deras egenskaper kan bestämmas. Vad kan FCM göra för den mikrobiologiska analysen av dricksvatten? FCM är en snabb, noggrann, kvantitativ och reproducerbar teknik för att räkna totala antalet bakterier när infärgning av nukleinsyran görs. Antalet bakterier som kan odlas på agarplatta är endast ca 1 % av totala antalet medans FMC räknar alla, med hög reproducerbart. Inom 15 min från inlämning till laboratorium för analys med FMC fås svar, jämfört med flera dygn för HPC.
FCM kan också räkna antalet levande bakterier i kombination med infärgning. Det senaste är att FCM kan skapa fingeravtryck av olika bakteriekulturer. Hur skiljer metoden mellan bakterier och icke-biologiska partiklar i vattnet? Olika infärgningar av DNA/RNA har testats. En infärgning, SYBR Green 1, har standardiserats och accepterats som metod i den schweiziska lagstiftning gällande dricksvatten. I artikeln ges flera exempel på händelser under distribution av dricksvatten där FCM ger en komplett bild av magnituden av en mikrobiologisk störning medan HPC med analys på samma prover endast sporadiskt detekterar förhöjda bakteriehalter. Vid en statistisk jämförelse visar HPC en hög standardavvikelse, 30 – 70 %, jämfört med <7% för FCM analyser gjorda på olika laboratorier och med olika instrument och ned till <2,5% för analyser med en operatör och ett instrument. Ett arbete som pågår och behöver lösas för FCM är standardisering. Det finns en potential att utveckla on-line tekniken för FCM vilket skulle ge stora vinster för övervakning av den mikrobiologiska kvalitén. FCM analysen är kostnadseffektiv enligt artikelförfattarna. Detta när flera än 15 analyser med konventionell HCP analys gör ger FCM lägre kostnad per analys. Kostnaden för investering i FCM är hög men HPC är betydligt mer arbetskrävande.
Författarna visar samtidigt på det obefintliga statistiska sambandet mellan FMC och HPC. Det förs en intressant diskussion i artikeln om istället för att FMC ersätter HPC så är den senare ett komplement. FMC ger relevant information om förändringar i utgående vattenkvalitet och i distributionssystemet där respektive vattenverk behöver bygga upp en databas med egna mätningar för att kunna sätta egna gränsvärden då universella inte är möjliga. Trots ännu inte fullt utvecklad standardisering av FMC analyser är reproducerbarheten hög. FMC är flexibel i den meningen att med olika infärgningar kan bakteriers livskraft och identitet kartläggas. Med FMC kan ett fingeravtryck av en bakteriekultur i dricksvattnet skapas och en s.k baslinje tas fram mot vilken avvikelser kan blottläggas. Fortsatt utveckling kan ge full automatiserad on-line mätning.
Slutsatser
En reflektion kring FCM är att den är en utvecklad teknik som bör få en betydligt större utrymme hos Sveriges vattenproducenter i övervakning av bakterieförekomst i råvatten, beredning av dricksvatten och mikrobiologiska förändringar under distribution. Då det inte finns några absoluta nivåer pga. att alla vatten har olika förutsättningar krävs förstås en anpassning till varje vattenverks råvatten och beredning. Frågan om tekniken kan lyftas in i lagstiftningen genom att gränsvärden införs för antal bakterier per ml kräver först omfattande undersökningar och säkert olika gränsvärden beroende på råvatten och beredning. Förekomst av indikatorbakterier som E.Coli och koliforma bakterier diskuteras inte artikeln och dessa analyser behöver fortsättningsvis utföras men när det bör göras borde FCM kunna visa. Ytterligare användning av tekniken kan vara att visa på integriteten för olika beredningssteg och dess mikrobiologiska barriärverkan. Här kan FMC med infärgning vara ett alternativ till partikelräknare.
Källa: S.Van Nevel, S. Koetzch, C.R. Procotor, M.D. Besmer. E.I. Prest, J.S. Vrouwenvelder, A. Knezev, N. Boon and F.Hammes.Flow cytometric bacterial cell counts challenge conventional heterotrophic plate counts for routine microbiological drinking water monitoring. Water Research 113 (2017) pp 191-206.
