Potentiella applikationer för nästa generation DNA sekvenserande av 16S rRNA genamplikoner i mikrobiologiska vattenanalyser. DNA-analysbaserad metodik är ett radikalt annorlunda sätt att bestämma mikrobiologisk status i miljön. Metodiken anses ännu (2015) inte utvecklad att finna en mindre population patogena bakterier utan lämpar sig bättre för att söka dominerande bakterieslag.
Av: Jörgen Hanaeus
Nyttan av nästa generation DNA-sekvensering (NGS) för att bestämma vattenkvalitet har inte fastslagits ännu. I föreliggande studie har en omfattande provomgång med analyser genomförts med prover från vatten, jord, sediment och fekalier.
Analyserna gjordes med 454 pyrosekvenseringar av bakteriernas 16S rRNA genamplikoner för att förstå metodens förmåga att 1) följa utvecklingen av miljöns molekylära diagnostik, 2) direkt grovuppdelning av bakteriesamhällen och 3) detektering av fekal förorening i vatten.
Man bedömde att NGS-metoder kan finna potentiella indikatorpopulationer för diagnostik som kan utnyttjas i vattnets mikrobiologi. Vidare kunde dominerande bakterieslag i prov återfinnas medan minoriteter som patogena bakterier var svårare att sortera ut.
Bakgrund
Molekylärbiologiska metoder har utvecklats och under de senaste 30 åren bidragit mycket till förståelsen av ekosystem och deras funktion. I vattenmikrobiologin har metoder anslutande till nukleinsyror hjälpt till att visa den mikrobiella världen i ett bredare perspektiv än vad som framgår av klassiska metoder som spårar enstaka bakterieslag.
En tidig gren var FISH-metoden (mikroskopibaserad fluorescens in situ hybridisering) som medgivit detektering av enstaka celler i sin naturliga omgivning. PCR-baserade metoder (Polymerase chain reaction) möjliggjorde specifik detektering och amplifiering av gener i miljöprover och undersökning av kompletta mikrobsystem inklusive virus och fager.
I dessa spår utvecklades typningsmetodiker som gelelektrofores (DGGE) och fragmentlängdspolymorfi (T-RFLP).
Alla dessa metoder bygger på utnyttjande av informationen i DNA-sekvenser för att nå önskad nukleinsyra (DNA eller RNA). De har varit tidskrävande och omständliga trots en god automatisering.
NGS, från ca 2005, har inneburit en avsevärd rationalisering genom att miljoner sekvensanalyser kan köras parallellt.
I den föreliggande studien har två angreppssätt provats:
1) Klarläggande av sammansättningen för mikrobsamhället via djupsekvensering av PCR-amplikoner för en genmarkör (oftast 16S rRNA genen) och
2) Metagenomisk analys av hela DNA- eller RNA-innehållet i ett prov ur miljön
Ansats 1 söker svar på frågan ”Vilka finns där?” medan ansats 2 undrar ”Vad kan samhället ifråga uträtta?”
Ansatserna är tämligen nya för vattensamhället (2015).
Försök
29 prov av olika slag: 11 ytvatten, 2 jord + 2 sediment (blandades) och 5 i avföring från djur togs ett år 2010-2011 kring en grundvattenakvifär, belägen i en nationalpark i utkanten av Wien. Därtill togs 9 avföringsprov från olika djur i en närliggande djurpark. Proverna finfördelades med bead-beating.
DNA extraherades och via PCR amplifierades i 25 cykler 16S rRNA-genen (triplikat). Alla amplikoner gav positiva utslag medan alla kontrollprov var negativa. Därefter sändes proverna till speciallab för 454 pyrosekvensering och kontroll mot databaser.
Resultat
Sekvenseringen gav sammanlagt 241 000 sekvensläsningar för proverna men antalet halverades efter kvalitetsfiltrering. Tre prover gav färre än 2000 filtreade sekvenser och uteslöts därför.
Dominerande bakterieslag i de fekala proverna var Firmicutes, följt av Bacteriodetes och Proteobacteria. För sediment och vatten dominerade Proteobacteria och Bacteroidetes men även Cyanobacteria.
De små mängderna av patogena bakterier fångades inte in. Parallella E.Coli analyser gav 7-300 kolonier/100 mL, men återfanns inte i sekvensbestämningarna; inte heller någon annan art ur genus Escherichia i hela datasetet.
Slutsatser
De föreslagna NGS-ansatserna var lämpliga för att finna de dominerande bakterieslagen i proverna, men inte de minoriteter som patogena bakterier utgör.
Metoderna blir billigare för varje månad så utmaningen blir att hantera de stora datamängder som produceras.
Utvecklingen är fortfarande snabb och från VA-facket kan det vara klokt att då och då ta en koll med aktuellt laboratorium om NGS-metoder är på väg in och vad de då kan användas till.
Källa: Vierheilig, J.1,2,3), Savio, D.1,2), Ley, R.E.4) , Mach, R.L.5), Farnleitner, A.H.1,6) & Reischer, G.H1,6), (2015). Potential applications of next generation DNA sequencing of 16S rRNA gene amplicons in microbiological water quality monitoring. Water Science & Technology, 72.11, pp 1962-1972.
Författarna från:
1) Research Group Environmental Microbiology and Molecular Ecology, Institute for Chemical Engineering, Vienna University of Technology, Gumpendorfer Strasse 1a, A-1060 Vienna, Austria
2) Centre for Water Resource Systems (CWRS), Vienna University of Technology, Karlsplatz 13/222, A-1040 Vienna, Austria
3) Division of Microbial Ecology, Department of Microbiology and Ecosystem Science, University of Vienna, Althanstrasse 14, A-1090 Vienna, Austria.
4) Department of Microbiology, Cornell University, Ithaca, NY 14853, USA
5) Gene Technology Group, Institute for Chemical Engineering, Vienna University of Technology, Gumpendorfer Strasse 1a, A-1060 Vienna, Austria
6) Interuniversity Cooperation Centre Water & Health, Institute for Chemical Engineering, Vienna University of Technology, Gumpendorfer Strasse 1a, A-1060 Vienna, Austria
Kontakt: georg.reischer@tuwien.ac.at
