Odling på platta dominerar fortfarande som teknik för att kontrollera mikrobiell aktivitet. I en översikt redovisas här teknik för räkning av bakterieceller som en alternativ metod, flödescytometri.
Av: Kenneth M Persson
I Sverige utfärdas kokningsrekommendationer på grund av misstänkt otjänligt dricksvatten ungefär en gång per vecka för allmänna ledningsnät. Den senaste större kokningsrekommendationen i Sverige gällde i delar av Lunds dricksvattennät från 9 mars till 11 april.
För mikrobiell kvalitetskontroll används fortfarande traditionella odlingsmetoder på platta där antalet utvuxna kolonier som går att se efter en viss tid, mellan 2 och 7 dygn för de svenska odlingsmetoderna, räknas av duktiga mikrobiologier, bedöms och rapporteras. Ibland visar analyserna för indikatororganismer på förhöjda halter och då kan olika extraordinära åtgärder behöva vidtas, där en är att utfärda kokningsrekommendation. Dessutom mäts den generella mikrobiella kvaliteten med det som förr hette heterotrofa bakterier och som i gällande dricksvattenföreskrifter heter totalantal mikroorganismer efter 3 dygn och långsamväxande bakterier efter 7 dygn.
Värdet av dessa två analysmetoder har diskuterats i många år och redan 2003 konstaterade Världshälsoorganisationen att analyser med odling av heterotrofer eller totalantal mikroorganismer inte ger någon bild av den hygieniska kvaliteten i dricksvattnet, eftersom odlingsmetoderna är alltför selektiva. Av kanske 200 000 bakterieceller per millilter dricksvatten klarar säg 2-10 av att växa i just det utvalda odlingsmediet medan övriga 199 990 till 199 998 inte klarar det.
Den tekniska utvecklingen inom mikrobiell kvalitetsbedömning av dricksvatten har pågått under lång tid sedan metoden för att odla bakterier i näringslösning på platta togs fram i slutet av 1800-talet (först var Robert Koch, 1881). Men ännu är odling på platta det absolut förhärskande sättet att kontrollera mikrobiell kvalitet och dessutom det av myndigheterna anvisade. Enligt EU:s dricskvattendirektiv och våra svenska dricksvattenföreskrifter skall odling göras med viss frekvens kopplad till hur stor volym dricksvatten som distribueras och vilken slags råvatten som används vid dricksvattenberedning.
Artikeln
I Van Nevel och medarbetares mycket intressanta och läsvärda översiktsartikel om flödescytometri i tidskriften Water Research (2017) utmanas odlingsmetoderna på allvar av den mycket snabbare flödescytometritekniken. Den perfekta metoden för att övervaka mikrobiologisk kvalitet i vattenverk och ledningsnät bör kunna detektera potentiella föroreningar eller försämringar på grund av biologiskt instabila vatten korrekt, enkelt, tillförlitligt, snabbt och kostnadseffektivt. Van Nevel och medarbetare listar fakta på fakta om att flödescytometri faktiskt gör detta.
Med flödescytometri (”cellräknare”) sorteras cellerna i ett prov ut och radas upp för att passera en laser individuellt så att varje cell kan räknas i provet. Det går att färga in cellernas DNA och cellmembran med hjälp av kommersiellt tillgängliga färgmedel, antikroppar eller andra reagens vilka kan analyseras vidare med hjälp av storlek och eventuella fluorescensegenskaper. Det går att skilja mellan intakta celler och totalantal celler där somliga är skadade eller döda. Det går att visa hur långa eller korta DNA-kedjorna är i de analyserade cellerna. Medicinskt har metoden används för att räkna och bedöma blodkroppar i blodprov åtminstone sedan tidigt 1970-tal, men tekniskt har metoden först de senaste 15 åren kommit att användas för att kontrollera dricksvattenkvalitet.
Fördelarna med flödescytometrin är snabbheten – det går att få ett resultat inom 15 minuter från provtagningen. Flödescytometern kan lätt automatiseras och producera upp till 500 provsvar per skift den är i drift. Den förbrukar endast låga volymer reagens per prov och kan på så sätt bli väldigt kostnadseffektiv jämfört med odlingsmetoder på platta. Van Nevel och medarbetare argumenterar för att kostnaden är bara en femtedel så hög vid flödescytometri som vid odling på platta i större laboratorier.
Kombinationen av olika infärningsreagens kan utvärderas statistiskt och generera ett mikrobiellt fingeravtryck som visar hur hela bakteriefloran ser ut. Då kan prover från samma ställe i vattenverket eller ledningsnätet jämföras i tid och stabilitet eller instabilitet i floran utvärderas. På så sätt kunde i ett fall analyser från ledningsnät visa att den bakteriella tillväxten skedde ute i silen i kranen hos abonnenten och inte i vattnet.
I en riktigt ambitiös sammanställning av 1 441 prover med flödescytometri och samtidig kontroll av total cellaktivitet genom förekomst av intracellulär ATP (adenosintrifosfat, cellens energibärande molekyl) visar artikelförfattarna att korrelationen är mycket hög mellan halten intakta bakterier enligt flödescytometrin och halten ATP. En motsvarande jämförelse mellan totalantal mikroorganismer enligt odling på platta respektive totalantal bakterier enligt flödescytometri visade ingen korrelation alls, varken för totalantal celler eller intakta celler.
Men har inte flödescytometrin några svagheter? Jodå, visst finns det begränsningar också här. Främsta begränsningen är att infärgning inte förmår att visa om DNA har skadats av UV-ljus vid desinfektion med UV-lampa. UV-ljuset tvärbinder främst DNA-molekylen men skadar som regel inte cellmembranet i cellen. Det går inte att skilja på tvärbundet DNA från oskadat DNA med flödescytometri. Vid odling på platta kan däremot de bakterier som har intakt DNA dela sig och räknas. På så sätt kan odling på platta användas för att kontrollera att UV-desinfektionen har någon effekt. Men denna begränsning i flödescytometrin torde kunna lösas genom mera forskning och utveckling av andra infärgningsmetoder.
Slutsats
Det är dags för myndigheter, laboratorier och vattenverk att bestämma sig för att komplettera odlingsmetoder med flödescytometri för att i sinom tid till och med ersätta den gamla metoden med den nya. Vem tar på sig att ta fram en avvecklingsplan för odlingsmetoderna? I Sverige vet vi att en bra avvecklingsplan sträcker sig 25 år fram i tiden, men redan år 2040 vågar vi kanske börja använda flödescytometri för att kontrollera dricksvattnet? Ett första steg är åtminstone att läsa hela artikeln i Water Research.
Källa: S. Van Nevel, S. Koetzsch, C.R. Proctor, M.D. Besmer, E.I. Prest, J.S. Vrouwenvelder, A. Knezev, N. Boon, F. Hammes: Flow cytometric bacterial cell counts challenge conventional heterotrophic plate counts for routine microbiological drinking water monitoring. Water Research (2017) 113 191–206
